以啤酒酵母为原料提取β—葡聚糖，建立了一种气相色谱测定β—葡聚糖和甘露聚糖（副产物）含量的方法。样品用三氟乙酸（TFA） 进行水解后，对水解单糖进行乙酰化，制备成糖腈乙酰酯衍生物，然后采用中极性柱进行气相色谱分析，最后以外标法定量测定。结果表明，β—葡聚糖和甘露聚糖的单糖成分经乙酰化后能得到较好的色谱分离效果，本实验制备的产品中β—葡聚糖和甘露聚糖的含量分别为32.39%和16.82%，回收率为87.14%—101.2%，此法可准确测定β—葡聚糖的含量。
本文借鉴了一些植物多糖中单糖组分的分析方法，采用气相色谱法直接测定葡萄糖含量，具有分析速度快、选择性强、灵敏度高和测定结果精确可靠等优点，从而为啤酒酵母中β—葡聚糖含量的测定提供新参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
啤酒酵母广州市珠江啤酒厂；β—葡聚糖日本ADEKA株式会社；风味蛋白酶、Alcalase2.4L 诺维信公司；丙酮、三氟乙酸、盐酸羟胺、吡啶、乙酸酐等天津市化学试剂一厂，分析纯；标准葡萄糖、甘露糖 上海源聚生物科技有限公司，分析纯。
1.2 .1仪器与设备
本实验采用乙酰化作为衍生化方法，其反应原理是：标准单糖和盐酸羟胺在溶剂吡啶中加热反应生成糖肟，以乙酸酐作为乙酰化试剂，在加热条件下继续反应，最后生成具有挥发性的糖腈乙酸酯衍生物。
GC—2014 气相色谱仪配备氢火焰离子化检测器FID ，日本岛津公司；KQ—250DE 型数控超声清洗器，昆山市超声仪仪器有限公司；雷磁PHS—3C 精密pH 计，上海精科仪器有限公司；N—EVAP111型氮吹仪，美国Organomation公司；5804R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；RE—52型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHZ—D(III) 型循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；HHS型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.2 .2β—葡聚糖的制备
工艺流程：新鲜啤酒酵母→200目过筛除去啤酒花等杂质→水洗除去剩余啤酒→离心分离→将沉淀溶于水配成反应体系进行自溶→加盐破壁→碱性蛋白酶酶解→离心分离→水洗沉淀→脱色脱脂→冷冻干燥→粉碎→成品
操作要点：自溶，在pH7.0环境中，按反应体积1%的量加入风味蛋白酶，50℃下反应24h；破壁，在pH10.5环境中，按反应体积3%的量加入NaCl，搅拌混匀，80℃下保持1h；酶解，在pH10.5环境中，按反应体积1%的量加入Alcalase2 .4L ，搅拌混匀，80℃下反应3h。
1.3.1β—葡聚糖和甘露聚糖的单糖含量分析
方法制备的β—葡聚糖成品中可能还有些其他物质，如甘露聚糖和蛋白质，其中甘露聚糖是由甘露糖构成的同一聚糖，本实验同时测定甘露聚糖的含量，为β—葡聚糖含量的测定提供参考。
准确称取10mg 固体单糖标准品（先在105 ℃下烘干至恒重）、10mg 盐酸羟胺于1.5mL小离心管中，加入0.5mL吡啶，放入90℃水浴中加热反应30min，间歇振荡。取出后冷却至室温，加入0.5mL乙酸酐，90℃下继续水浴加热反应30min，离心后取适量上清液直接进行气相色谱分析。
1.3. 2 葡萄糖和甘露糖标准曲线的绘制
准确称取标准葡萄糖和甘露糖各10mg，乙酰化后，葡萄糖和甘露糖衍生物浓度同为10mg/mL，分别将此浓度葡萄糖和甘露糖衍生物按比例混合，配制成1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL和5mg/mL的混合糖液，同时做空白对照，立即进行气相色谱分析，记录色谱峰面积，以其为纵坐标，并以混合糖液中每种糖的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
1.3.3 啤酒酵母多糖的水解和衍生化准确称取10mg多糖粉末于10mL离心试管中，加入2mL75%三氟乙酸，封管，90℃下水浴3h，间歇振荡，待酸水解完取出，将试管接入氮吹仪在80℃下蒸干，再加入1mL甲醇再次蒸干，重复3 次，以去除残留三氟乙酸。
1. 3.4 色谱条件
气相色谱柱：DB—17 石英毛细管柱(30 m×0.32 mm，液膜厚0.25μm，Agilent) ；升温程序：初温为160℃，以5℃/min 升温至180℃，再以2℃/min 升温至210℃，保留5min ；进样口温度：230℃，检测器温度：250℃；
载气（氮气）流速：20mL/min，氢气流速：45mL/min，空气流速：400mL/min；分流比20：1，进样量1μL。
乙酰化后，标准葡萄糖和甘露糖衍生物的气相色谱分析结果如图1 所示，分析表明采用糖腈乙酸酯衍生化的方法，一种单糖只对应一种衍生化产物，在较低的200 ℃下即可分离出来。
两种标准单糖衍生物保留时间分别为14.347min和15.016min，分析表明在1. 3.4 所采用的气相色谱条件下，混合单糖中的两种单糖出峰时间短，峰形对称，隔得较开，并未出现拖尾现象。
2 实验分析
2 .1 两种标准单糖衍生物的标准曲线
葡萄糖衍生物标准曲线（见图1 ），甘露糖衍生物标准曲线（见图2）。
根据标准葡萄糖和甘露糖衍生物标准曲线绘制的操作步骤。从曲线趋势来看，两种单糖衍生物出峰面积随着糖浓度的增大而呈线性增长。
2 .2 样品水解单糖乙酰化产物的气相色谱分析
ADEKA 株式会社是日本最大的β—葡聚糖生产公司，这里将其进口产品与本实验室制备的成品中葡聚糖和甘露聚糖含量进行比较，将两种样品水解并乙酰化后，按与混合标样相同的色谱haicent.com分析条件进行气相色谱分析，结果分别如图4 和图5 所示，其水解单糖保留时间与标准混合单糖的保留时间对比分析表明，水解后的两种单糖分别为葡萄糖和甘露糖，其中葡萄糖含量较高。β—葡聚糖水解衍生化气相色谱图（见图3）。
2 .3 啤酒酵母中β—葡聚糖和甘露聚糖的含量计算
根据样品中水解后每种单糖气相分析的峰面积，代入葡萄糖和甘露糖的标准曲线，可算出葡萄糖和甘露糖的浓度，进一步计算出样品中葡萄糖和甘露糖含量，从而最终得到β—葡聚糖和甘露聚糖的含量，所有计算结果（见表1）。
从表1可以看出， 实验室制备的β—葡聚糖和甘露聚糖与日本进口β—葡聚糖的含量都比较接近。样品中组分测定的重现性实验结果（见表2 ）。
根据2.3测定的结果， 每10mg 样品中β—葡聚糖和甘露聚糖含量分别为3.239mg和1.682mg，分别添加5mg葡萄糖和甘露糖进行测定，结果如表3所示，加标回收率为87.14%—101.2%，说明该方法准确性高， 能够满足检测要求。样品中组分的回收率实验结果（见表3 ）。
3 结论
本实验建立的啤酒酵母β—葡聚糖含量的气相色谱测定法，前处理简单、操作方便、重现性好、选择性强、精密度高，符合实验室对β—葡聚糖含量测定方法的要求。
在这个分析过程中，要注意：
第一，糖类衍生化方法要求制备简便、试剂易得，而且每种单糖要得到单一的色谱峰，这对单糖的定量分析是十分重要的；第二，色谱柱对于分离效果也很重要，在气相条件探索过程中，比较了AC—5（非极性）和DB—17（中极性）两种毛细管色谱柱，发现AC-5 出峰慢，分离不彻底，而DB—17 在较低温度下很快就能出峰，而且不同单糖峰形对称，分隔较开，效果很好，于是选择DB—17作为分析色谱柱。
